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電泳檢驗測定:質粒電泳普通有三條帶,作別為質粒的超螺旋、開環(huán)、線型三種構型
吸光值檢驗測定:認為合適而使用分光光度計檢驗測定260nm、280nm波長吸光值,若吸光值260nm/280nm的比率介于1.7-1.9之間,解釋明白質粒品質較好,1.8為*,低于1.8解釋明白有氨基酸污染,大于1.8解釋明白有RNA污染。
實驗材料:包括質粒pUC18載體的結腸桿菌菌液,克隆有稻子外源斷片的BAC的結腸桿菌菌液電熱恒溫鼓風干燥箱。
實驗原理:在pH 12.0 ~ 12.6堿性背景中,球菌的線性大分子量染色體DNA改變性別分開,而共價閉環(huán)的質粒DNA固然改變性別但仍處于拓撲攪擾狀況。將pH調至中性并有高鹽存在及低溫的條件下,大多染色體DNA、大分子量的RNA和氨基酸在去污劑SDS的效用下形成沉淀,而質粒DNA還是為可溶狀況。經過離心,可去掉除掉大多細胞碎片、染色體DNA、RNA及氨基酸,質粒DNA尚在上清中,而后用酚、氯仿抽提進一步醇化質粒DNA。
實驗步驟:
1.取包括pUC18質粒的結腸桿菌菌液于LA營養(yǎng)物質上真空干燥箱37℃過夜培育;
2.汲取1.5 ml菌液,12000 g離心2分鐘,使聚在一起菌體,倒掉菌液;汲取1.5 ml菌液,再次使聚在一起菌體,盡力將菌液倒整潔;
3.參加300 ml溶液 I振動打勻,從新懸浮細胞,震動混電熱鼓風干燥箱勻(注意:應*打勻沉淀或碎塊);
4.用無菌牙簽兒挑取單菌落,接種于包括Amp抗生素的LB營養(yǎng)物質中,37℃搖床~250 r/min過夜培育;
5.參加300 ml溶液III顛倒混勻,安放于冰上10分鐘,使雜質充分沉淀;
6.參加300 ml溶液II,輕柔顛倒混勻,安放至清脆,普通不超過5分鐘;
7.12000 g離心10分鐘;
8.汲取800 ml上清液(注意:不要汲取到漂浮的雜質)至另一Eppendorf管中,參加2/3大小的異丙醇,室溫下安放5分鐘干燥箱;
9.質粒、BAC的品質檢驗測定,于-20℃保留。
10.倒盡上清,加75酒精浸洗除鹽(安放一會兒或離心3分鐘后倒去上清);
11.12000 g 常溫離心15分鐘;
12.室溫安放或超凈臺上風干DNA;
13.加40 ml滅菌超純水或TE溶解;
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