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lin-4,第1個已知的miRNA,在1993年被發(fā)覺。自此,miRNA的研討就一發(fā)無法收拾。線蟲、蜾蠅等標(biāo)準(zhǔn)樣式有生命的物質(zhì)的研討鑒定出miRNA的很多重邀功能,涵蓋發(fā)育時期細(xì)胞增生和失去生命的協(xié)調(diào),抗逆性,脂肪代謝等等。相對于這些個劣等的標(biāo)準(zhǔn)樣式有生命的物質(zhì),哺乳動物的miRNA功能研討可就復(fù)雜得多。
在著手的幾年,科學(xué)家們的首重要的條目標(biāo)是利用克隆、有生命的物質(zhì)信息學(xué)和基因表現(xiàn)等辦法編綴出完整的miRNA目次和它的表現(xiàn)形式。隨著這個目的一天比一天靠近,研討重心又轉(zhuǎn)移至miRNA功能的解釋。針對這一目的,涌現(xiàn)出多種技術(shù),有報告陳述基因剖析、原位雜交、過表現(xiàn)和沉默、有生命的物質(zhì)信息學(xué)預(yù)先推測算法等,他們都有助于miRNA功能的推斷。
剖析miRNA的表現(xiàn)
在鑒定新的miRNA時,一般認(rèn)為合適而使用三種辦法:正向遺傳基因?qū)W、定向克隆和有生命的物質(zhì)信息學(xué)剖析。正向遺傳基因?qū)W主要使用于蜾蠅和線蟲中,它經(jīng)過一個突變表型來理解miRNA的功能。第1個miRNA基因lin-4就是這樣鑒定出的。不過,正向遺傳基因?qū)W這樣積年來也就鑒定出非常少幾個miRNA。這是由于miRNA細(xì)小,只要突變不影響胚珠序列,他們就有潛在力量耐受,因為這個很難擊中。額外,因為冗余,表型用篩子選不可以辨別眾多miRNA突變體。因為這個正向遺傳基因?qū)W沒可能變成鑒定miRNA的主力軍。
在這以后,定向克隆技術(shù)的顯露出來,讓多種細(xì)胞系和團(tuán)體中的miRNA大規(guī)模鑒定得以成功實現(xiàn),涵蓋人、小鼠和斑馬魚等。miRNA的克隆流程大概如下所述:在改變性別的聚丙烯酰胺凝膠上離合RNA樣品,并回收體積在18-25 nt的斷片。繼續(xù),給RNA加上5’和3’接頭,并施行RT-PCR,而后將斷片克隆到載體上,構(gòu)建出cDNA文庫。對單個克隆施行測序和剖析,以確認(rèn)小RNA。到現(xiàn)在為止測序技術(shù)的興盛也大大增進(jìn)了這種辦法。不過對于某些只在特別細(xì)胞類型中表現(xiàn),或以低水準(zhǔn)表現(xiàn)的miRNA來說,鑒定起來仍然有困難程度的。額外,介于物理性質(zhì)或轉(zhuǎn)錄后修飾,某些miRNA有可能難于克隆,這也是一個棘手的問題。
同時,科學(xué)家們也研發(fā)出多種算法,來預(yù)先推測miRNA。所得法法都利用了二級結(jié)構(gòu)信息,由于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的存在是miRNA的主要特點(diǎn)標(biāo)志。那里面很多辦法還有賴序列的守舊性來區(qū)別miRNA候選物和無關(guān)的基因組發(fā)夾。另一點(diǎn)辦法則評估發(fā)夾結(jié)構(gòu)的熱力科學(xué)牢穩(wěn)性,與已知miRNA的序列和結(jié)構(gòu)相仿度。另一種的辦法是考求已知miRNA四周圍的基因組序列,由于很多miRNA都是成簇排布。上下團(tuán)結(jié)小鼠的很多miRNA就是經(jīng)過這種形式鑒定出的。當(dāng)然,計算機(jī)預(yù)先推測出來的候選miRNA還需求實驗的證驗。
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